研究单位：四川大学生物治疗国家重点实验室

一、实验目的

考察解本303发酵液对线虫的抗衰老作用。

二、实验材料

实验线虫株系：野生型线虫株系C. elegans Bristol N2

实验菌株：尿嘧啶缺陷型大肠杆菌（OP50）,此类菌株无法自身合成尿嘧啶，自身生长所需的尿嘧啶需从固体培养基中摄取。

实验药液及配置方法：取解本303发酵液，摇匀，在超净工作台中用0.22μm水性微孔滤膜过滤除菌。分装至1ml无菌EP管中，用封口膜封住，放置于室温待用。使用时将发酵液于超净工作台中打开，摇匀，用培养基稀释至浓度为原来的1%、2%、4%、7%、8%、10%、14%，25%。

三、秀丽隐杆线虫实验方法

本实验分为实验组和对照组，在生化培养箱中将同步化的秀丽隐杆线虫培养至young adult时期，在体视镜下用铂金丝挑取生长状态良好且虫体大小均匀的秀丽隐杆线虫至涂有OP50菌的NGM 6孔板中，每个孔约150只秀丽隐杆线虫，尽量保持虫体大小一致且实验组与对照组只数保持一致。

实验组在涂有OP50菌的NGM板上平铺一层解本303发酵液，对照组则平铺酒精和水的混合溶液，此时按照线虫寿命天数第一天记录，前七天需要每天观察并转移秀丽隐杆线虫至新的干净的NGM 6孔板中，确保秀丽隐杆线虫的生活状态良好，食物充足，没有杂菌污染，第七天之后可以每隔一天转移一次，因为此时秀丽隐杆线虫几乎不再具备生殖能力，此时需要每天观察秀丽隐杆线虫的生长情况并记录秀丽隐杆线虫每天的死亡数目，包括正常死亡及非正常死亡，整理数据，最后使用软件GraphPad Prism 8 制作生存曲线图，对比实验曲线图得出实验结果。

判断秀丽隐杆线虫的死亡方法：

1. 用铂金丝轻轻碰触秀丽隐杆线虫身体，观察秀丽隐杆线虫是否有反应。

2. 在显微镜下观察秀丽隐杆线虫的咽部是否会抽动。

四、实验步骤

1. 确定解本303发酵液不同浓度对线虫的生长状况及生殖能力影响：将同步化至成虫第一天的线虫挑进含有不同浓度（1%、2%、4%、7%、8%、10%、14%，25%）的铺满大肠杆菌的固体培养皿中，此时记作day1，此后在day2，day3，day4，day5，day6，day7时观察线虫生长状况及生殖能力，确定解本303发酵液对线虫的生长及生殖不会产生不良影响的安全浓度范围；

2. 确定对照组酒精浓度对线虫的生长状况是否有影响：按照上一步骤确定的解本303发酵液的安全浓度换算成相应酒精浓度，再将同步化至成虫第一天的线虫挑进含有不同酒精浓度（0.12%、0.24%、0.48%、0.84%、0.96%、1.2%）的铺满大肠杆菌的固体培养皿中，此时记作day1，此后在day2，day3，day4，day5，day6，day7时观察线虫生长状况及生殖能力，确定与实验组相对应的酒精浓度对线虫的生长及生殖产生不良影响。

3. 确定在解本303发酵液安全浓度下添加抑制线虫生殖的药物FUDR是否会对线虫的生长造成影响。

五、实验结果

解本303发酵液在4%浓度下对线虫平均寿命有7%延长作用，最大寿命有15%延长作用。

（ A图、B图、C图依次是线虫在解本303发酵液最终浓度2%，4%，8%的生存曲线。）

线虫在解本303发酵液最终浓度2%，4%，8%的生存曲线统计见下表：